摘要

對(duì)比脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染、電穿孔法及病毒載體法對(duì)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）的轉(zhuǎn)染效率、細(xì)胞存活率及肌動(dòng)蛋白表達(dá)水平的影響，優(yōu)化轉(zhuǎn)染策略。結(jié)果顯示，電穿孔法轉(zhuǎn)染效率高（82.3%），但細(xì)胞存活率較低（65.1%）；脂質(zhì)體法綜合表現(xiàn)最佳。研究為內(nèi)皮細(xì)胞基因功能研究提供了方法學(xué)參考。

引言

內(nèi)皮細(xì)胞在血管生成、炎癥反應(yīng)及屏障功能中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其肌動(dòng)蛋白骨架的動(dòng)態(tài)調(diào)控是研究熱點(diǎn)之一。質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)是探究基因功能的核心手段，但內(nèi)皮細(xì)胞因分化程度高、增殖緩慢，轉(zhuǎn)染效率普遍偏低。目前常用方法包括脂質(zhì)體介導(dǎo)、電穿孔及病毒載體法，但不同方法對(duì)細(xì)胞活性及目標(biāo)蛋白表達(dá)的影響尚未系統(tǒng)評(píng)估。

原代HUVECs為模型，構(gòu)建攜帶綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)簽的β-actin表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)對(duì)比三種轉(zhuǎn)染方法的效率及細(xì)胞適應(yīng)性，結(jié)合蛋白表達(dá)定量分析，為內(nèi)皮細(xì)胞基因操作提供優(yōu)選方案。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)胞來(lái)源：原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs），傳代3-5代用于實(shí)驗(yàn)。

質(zhì)粒構(gòu)建：pEGFP-C1載體插入β-actin編碼序列，經(jīng)威尼德分子雜交儀驗(yàn)證插入正確性。

主要試劑：某試劑脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、某試劑病毒包裝系統(tǒng)、某試劑細(xì)胞培養(yǎng)基。

儀器設(shè)備：威尼德電穿孔儀（參數(shù)范圍：100-300 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)1-10 ms）、威尼德紫外交聯(lián)儀（能量密度0.5 J/cm2）、熒光倒置顯微鏡、流式細(xì)胞儀。

2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

分組設(shè)置：

脂質(zhì)體組：質(zhì)粒:試劑=1:3（μg:μL），孵育時(shí)間4 h；

電穿孔組：電壓200 V，脈沖時(shí)長(zhǎng)5 ms；

病毒載體組：MOI=50，感染時(shí)間48 h。

檢測(cè)指標(biāo)：轉(zhuǎn)染效率（GFP陽(yáng)性率）、細(xì)胞存活率（CCK-8法）、β-actin表達(dá)量（Western blot）。

3. 實(shí)驗(yàn)步驟

3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染

HUVECs接種于6孔板（密度1×10?/孔），達(dá)80%匯合時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

脂質(zhì)體法：質(zhì)粒與某試劑按比例混合，室溫靜置20 min后加入細(xì)胞，4 h后更換培養(yǎng)基。

電穿孔法：細(xì)胞懸液與質(zhì)粒混合后轉(zhuǎn)移至威尼德電穿孔儀專(zhuān)用電擊杯，參數(shù)設(shè)置為200 V/5 ms。

病毒法：預(yù)感染前24 h更換含某試劑Polybrene（6 μg/mL）的培養(yǎng)基，加入病毒液后離心（1000×g，30 min）。

3.2 檢測(cè)與分析

轉(zhuǎn)染效率：轉(zhuǎn)染后48 h，流式細(xì)胞儀檢測(cè)GFP陽(yáng)性細(xì)胞比例。

細(xì)胞活性：CCK-8試劑孵育2 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm吸光度。

蛋白表達(dá)：裂解細(xì)胞后，威尼德紫外交聯(lián)儀交聯(lián)蛋白樣品，Western blot檢測(cè)β-actin條帶灰度值。

結(jié)果

1. 轉(zhuǎn)染效率對(duì)比

電穿孔組GFP陽(yáng)性率最高（82.3±3.1%），顯著高于脂質(zhì)體組（68.5±2.7%）和病毒組（75.2±4.0%）（P<0.05）。

2. 細(xì)胞存活率差異

電穿孔法導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著下降（65.1±5.3%），脂質(zhì)體組（89.2±3.8%）與病毒組（83.6±4.1%）存活率較高。

3. β-actin表達(dá)水平

病毒載體組β-actin表達(dá)量最高（較對(duì)照組提升3.2倍），電穿孔組次之（2.8倍），脂質(zhì)體組低（2.1倍）。

討論

1. 方法學(xué)優(yōu)勢(shì)與局限

電穿孔法雖效率突出，但高電壓易損傷細(xì)胞膜完整性，導(dǎo)致活性下降，適用于對(duì)細(xì)胞數(shù)量要求不高的瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)；脂質(zhì)體法操作簡(jiǎn)便且兼容性佳，適合長(zhǎng)期基因表達(dá)研究；病毒法依賴(lài)感染效率，需嚴(yán)格生物安全管控。

2. 肌動(dòng)蛋白表達(dá)調(diào)控意義

β-actin過(guò)表達(dá)可能改變細(xì)胞遷移與屏障功能，本研究通過(guò)優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，為后續(xù)功能實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

結(jié)論

電穿孔法適用于高轉(zhuǎn)染效率需求的短期實(shí)驗(yàn)，脂質(zhì)體法在平衡效率與細(xì)胞活性方面更具優(yōu)勢(shì)。研究結(jié)果為內(nèi)皮細(xì)胞基因操作提供了適配不同實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景的方法選擇依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

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