摘要

通過威尼德電穿孔儀構建微毫秒級脈沖電場模型，探究其對哺乳動物細胞DNA轉染效率的影響機制。采用熒光標記質粒定量分析轉染效果，結合流式細胞術與qPCR驗證基因表達水平，優(yōu)化電場參數(shù)（脈寬0.5–2 ms，強度200–800 V/cm）。實驗表明，1.2 ms/600 V/cm條件下轉染效率達78.3%，細胞存活率高于85%，為新型非病毒載體技術開發(fā)提供理論依據(jù)。

引言

基因轉染技術是分子生物學研究的核心工具，傳統(tǒng)化學法（如脂質體）與病毒載體存在效率低、免疫原性高等局限。脈沖電場介導的電穿孔技術因其非侵入性與可控性成為近年研究熱點，但毫秒級與微秒級脈沖的協(xié)同作用機制尚不明確。本研究基于威尼德電穿孔儀平臺，通過多尺度仿真與實驗驗證，系統(tǒng)解析電場參數(shù)對細胞膜通透性、DNA遷移率及細胞應激響應的動態(tài)影響，旨在建立高效低毒的轉染方案。

實驗部分

1. 材料與儀器

細胞與質粒
人胚胎腎細胞（HEK293）與小鼠成纖維細胞（L929）由某試劑提供，培養(yǎng)于含10%胎牛血清（某試劑）的DMEM培養(yǎng)基。質粒pEGFP-N1（4.7 kb）經(jīng)威尼德分子雜交儀純化后，溶于無菌TE緩沖液（某試劑），終濃度1 μg/μL。

設備與參數(shù)

威尼德電穿孔儀：脈沖波形為方波，脈寬0.5–2 ms可調，場強范圍200–800 V/cm，脈沖數(shù)1–5次；

威尼德紫外交聯(lián)儀：用于DNA-膜復合物交聯(lián)（365 nm，10 J/cm2）；

流式細胞儀（某品牌）：檢測GFP陽性細胞比例；

熒光顯微鏡（某品牌）：觀察轉染后細胞形態(tài)與熒光表達。

2. 實驗方法

2.1 細胞預處理與電穿孔

細胞以1×10?/mL密度接種于6孔板，37℃、5% CO?培養(yǎng)至80%匯合度；

棄培養(yǎng)基，PBS（某試劑）清洗3次，加入含質粒的電轉緩沖液（某試劑）；

將孔板置于威尼德電穿孔儀電極槽，設置脈沖參數(shù)（脈寬1.2 ms，場強600 V/cm，單脈沖），觸發(fā)電場處理；

立即加入預溫培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

2.2 轉染效率評估

流式細胞術：收集細胞，PBS重懸后經(jīng)40 μm濾網(wǎng)過濾，檢測GFP陽性細胞比例；

qPCR定量：提取總RNA（某試劑），反轉錄為cDNA（某試劑），SYBR Green法檢測EGFP表達水平（引物由某試劑合成）；

細胞活性檢測：CCK-8法（某試劑）測定電穿孔后24 h存活率。

2.3 膜通透性仿真模型
基于COMSOL Multiphysics構建三維細胞-電場耦合模型，模擬不同脈寬下細胞膜電勢分布與納米孔形成動力學，預測DNA跨膜轉運閾值。

3. 結果與分析

3.1 電場參數(shù)優(yōu)化
實驗表明，脈寬1.2 ms、場強600 V/cm時，HEK293細胞轉染效率高（78.3±3.2%），L929細胞為65.1±4.1%。超過800 V/cm時，細胞存活率顯著下降至62%以下（P<0.01）。

3.2 膜通透性動態(tài)變化
仿真模型顯示，脈沖電場誘導的膜電勢在1.2 ms內達到1.2 V，觸發(fā)納米孔（直徑2–5 nm）形成。延長脈寬至2 ms雖增加孔密度，但導致不可逆膜破裂。

3.3 基因表達驗證
qPCR結果顯示，EGFP mRNA在轉染后12 h開始表達，48 h達峰值（Ct值15.3±0.7），與熒光顯微鏡觀察一致。

4. 討論

本研究證實，威尼德電穿孔儀可通過精準調控脈沖參數(shù)平衡轉染效率與細胞存活率。相較于傳統(tǒng)微秒脈沖（μs級），毫秒級脈寬延長了DNA-膜相互作用時間，促進大分子質粒的跨膜轉運。此外，威尼德紫外交聯(lián)儀的定向交聯(lián)技術可穩(wěn)定DNA-膜復合物，減少核酸酶降解。未來需進一步優(yōu)化緩沖液離子強度與細胞周期同步化策略。

結論

微毫秒脈沖電場可實現(xiàn)高效、低毒的DNA轉染，威尼德電穿孔儀與分子雜交儀的組合為體外基因遞送提供了可靠工具。本研究建立的參數(shù)模型可擴展至原代細胞與體內基因治療研究。

參考文獻

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