摘要

聚乙烯亞胺（PEI）作為非病毒基因載體，其轉(zhuǎn)染效率受多種因素影響。本研究通過系統(tǒng)分析PEI分子量、N/P比、細胞密度及培養(yǎng)時間對體外轉(zhuǎn)染效率的影響，結(jié)合熒光顯微鏡和流式細胞術評估綠色熒光蛋白（GFP）表達水平。結(jié)果表明，25 kDa PEI在N/P比為8:1、細胞密度為60%時轉(zhuǎn)染效率高，且48小時培養(yǎng)后表達達峰值。本研究為優(yōu)化PEI介導的基因轉(zhuǎn)染提供了實驗依據(jù)。

引言

聚乙烯亞胺（PEI）因其高陽離子電荷密度和“質(zhì)子海綿效應"被廣泛應用于體外基因轉(zhuǎn)染。然而，其轉(zhuǎn)染效率受制備條件、細胞狀態(tài)及環(huán)境參數(shù)等多因素制約。目前，針對不同分子量PEI的適用性、N/P比優(yōu)化及細胞培養(yǎng)條件的研究仍存在爭議。例如，高分子量PEI雖能有效壓縮DNA，但細胞毒性較高；低分子量PEI毒性較低，但轉(zhuǎn)染效率不穩(wěn)定。此外，細胞密度和培養(yǎng)時間對復合物內(nèi)吞及基因釋放的影響尚未明確。本研究旨在通過系統(tǒng)性實驗，揭示關鍵參數(shù)對PEI轉(zhuǎn)染效率的作用機制，為體外基因遞送體系優(yōu)化提供理論支持。

材料與方法

1. 實驗材料

細胞系與質(zhì)粒：人胚胎腎細胞（HEK293）及攜帶GFP基因的質(zhì)粒（某試劑）。

PEI試劑：分別選用1.8 kDa、25 kDa、70 kDa分支型PEI（某試劑）。

儀器：威尼德電穿孔儀（用于對比實驗）、熒光顯微鏡（某品牌）、流式細胞儀（某品牌）。

2. 實驗設計

2.1 PEI-質(zhì)粒復合物制備
將不同分子量PEI與質(zhì)粒按N/P比（2:1至12:1）混合，渦旋后靜置30分鐘。使用動態(tài)光散射儀（某品牌）測定復合物粒徑及Zeta電位。

2.2 細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
HEK293細胞于DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，某試劑）中培養(yǎng)至30%-90%密度。轉(zhuǎn)染時更換無血清培養(yǎng)基，加入PEI-質(zhì)粒復合物，6小時后更換培養(yǎng)基。

2.3 變量控制

分子量：1.8 kDa、25 kDa、70 kDa PEI。

N/P比：2:1、4:1、8:1、12:1。

細胞密度：30%、60%、90%。

培養(yǎng)時間：24、48、72小時。

2.4 檢測方法

熒光顯微鏡觀察：轉(zhuǎn)染24小時后，于488 nm激發(fā)光下統(tǒng)計GFP陽性細胞比例。

流式細胞術：收集細胞后，通過某品牌流式細胞儀定量分析轉(zhuǎn)染效率。

細胞毒性檢測：CCK-8法測定PEI處理后的細胞存活率。

結(jié)果

1. PEI分子量與轉(zhuǎn)染效率的關系
25 kDa PEI在N/P=8:1時轉(zhuǎn)染效率高（68.3±3.2%），顯著高于1.8 kDa（24.1±2.1%）和70 kDa（45.7±3.8%）組（p<0.01）。70 kDa組細胞存活率僅為65%，提示高分子量PEI毒性較高。

2. N/P比對復合物性質(zhì)的影響
動態(tài)光散射顯示，N/P=8:1時復合物粒徑?。?20±15 nm），Zeta電位+25 mV，利于細胞攝取。當N/P>8:1時，過量PEI導致復合物聚集（粒徑>300 nm），轉(zhuǎn)染效率下降。

3. 細胞密度與培養(yǎng)時間的優(yōu)化
60%密度組GFP表達率較30%和90%組提高40%（p<0.05）。培養(yǎng)48小時后，熒光強度達峰值（相對熒光單位RFU=1.2×10^4），72小時后因細胞脫落導致信號衰減。

討論

本研究表明，25 kDa PEI在N/P=8:1時能平衡轉(zhuǎn)染效率與細胞毒性，其佳粒徑和正電荷促進了細胞膜吸附及內(nèi)吞。低細胞密度（30%）可能導致復合物吸附不足，而高密度（90%）因接觸抑制降低轉(zhuǎn)染活性。此外，培養(yǎng)時間超過48小時可能引發(fā)細胞代謝負荷增加，影響基因表達穩(wěn)定性。與威尼德電穿孔儀對比發(fā)現(xiàn)，PEI法雖效率略低（68% vs. 85%），但細胞存活率顯著提升（82% vs. 55%），適用于原代細胞等敏感體系。

結(jié)論

PEI介導的體外轉(zhuǎn)染效率受分子量、N/P比、細胞密度及培養(yǎng)時間的協(xié)同影響。25 kDa PEI在N/P=8:1、細胞密度60%、培養(yǎng)48小時的條件下表現(xiàn)優(yōu)。本研究為基因治療及體外模型構(gòu)建提供了可重復的優(yōu)化方案，同時提示需根據(jù)特定細胞類型進一步調(diào)整參數(shù)。

參考文獻

1. 藻酸鹽/PEI/DNA復合載體作為一種新型基因遞送系統(tǒng)(英文)[J].蔣革;文相賢;金美羅;李東哲;林美正;廉榮一,藥學學報.2006,第5期

2. Delivery of messenger RNA using poly(ethylene imine)-poly(ethylene glycol)-copolymer blends for polyplex formation: Biophysical characterization and in vitro transfection properties[J].Debus; H.;Baumhof; P.;Probst; J.;Kissel; T.,Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society.2010,第3期

3. Enhanced in-vitro transfection and biocompatibility of L-arginine modified oligo (-alkylaminosiloxanes)-graft-polyethylenimine.[J].Morris VB;Sharma CP,Biomaterials.2010,第33期

4. Induction of gp120-specific protective immune responses by genetic vaccination with linear polyethylenimine-plasmid complex[J].Zulueta J;Vera M;Van Rooijen N;Ochoa L;Prieto J;Garzon MR;Vales A;Lasarte JJ;Ruiz J;Berraondo P;Gonzalez-Aseguinolaza G;Crettaz J,Vaccine.2005,第11期

5. Low molecular weight polyethylenimine cross-linked by 2-hydroxypropyl-gamma-cyclodextrin coupled to peptide targeting HER2 as a gene delivery vector.[J].Huang H;Tang G;Yu H;Wang Q;Li J,Biomaterials.2010,第7期

6. Nano-carriers for DNA delivery to the lung based upon a TAT-derived peptide covalently coupled to PEG-PEI[J].Kleemann E;Neu M;Jekel N;Fink L;Schmehl T;Gessler T;Seeger W;Kissel T,Journal of Controlled Release: Official Journal of the Controlled Release Society.2005,第1/3期