摘要：本研究聚焦于蟬抗菌肽 Cryptonin 在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定。通過基因克隆技術(shù)獲取 Cryptonin 基因，構(gòu)建重組表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母中。優(yōu)化培養(yǎng)條件以提高表達(dá)量，利用多種蛋白純化和鑒定方法，包括親和層析、高效液相色譜、質(zhì)譜分析及抗菌活性檢測(cè)等，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行全面分析。結(jié)果成功實(shí)現(xiàn)了 Cryptonin 在畢赤酵母中的高效表達(dá)，并證實(shí)了表達(dá)產(chǎn)物具有預(yù)期的抗菌活性，為 Cryptonin 的大規(guī)模生產(chǎn)和進(jìn)一步的醫(yī)藥應(yīng)用研究提供了有力支持。

一、引言

抗菌肽作為生物免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，具有廣譜抗菌活性、作用機(jī)制更好且不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，成為近年來醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。蟬抗菌肽 Cryptonin 是其中一種具有潛力的抗菌肽，在天然防御病原體入侵方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。研究其在畢赤酵母中的表達(dá)與鑒定，對(duì)于開發(fā)新型抗菌藥物具有重要意義。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以其能夠高效表達(dá)外源蛋白、易于基因操作、可對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行翻譯后修飾等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于重組蛋白的生產(chǎn)。將 Cryptonin 在畢赤酵母中進(jìn)行表達(dá)，有望實(shí)現(xiàn)其大規(guī)模生產(chǎn)，滿足醫(yī)藥研發(fā)對(duì)大量高純度抗菌肽的需求。本研究旨在建立穩(wěn)定、高效的 Cryptonin 在畢赤酵母中的表達(dá)體系，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定，為后續(xù)的應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

二、材料與方法

（一）材料

菌株和載體
蟬來源的 Cryptonin 基因模板、畢赤酵母菌株 GS115、表達(dá)載體 pPICZαA。

試劑
限制性內(nèi)切酶（如 EcoR I、Xba I）、T4 DNA 連接酶、DNA 聚合酶、瓊脂糖、酵母提取物、蛋白胨、山梨醇、甲醇、各種抗生素、鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱、高效液相色譜（HPLC）分析所需的流動(dòng)相試劑、用于質(zhì)譜分析的基質(zhì)等。

（二）方法

Cryptonin 基因的克隆
從蟬組織中提取總 RNA，通過逆轉(zhuǎn)錄 - 聚合酶鏈反應(yīng)（RT - PCR）獲得 Cryptonin 的 cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物，在引物兩端引入合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)（如 EcoR I 和 Xba I），以 cDNA 為模板進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，得到帶有酶切位點(diǎn)的 Cryptonin 基因片段。PCR 反應(yīng)條件經(jīng)過優(yōu)化，包括退火溫度、延伸時(shí)間等參數(shù)，確保擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性和產(chǎn)量。

重組表達(dá)載體的構(gòu)建
將擴(kuò)增得到的 Cryptonin 基因片段和表達(dá)載體 pPICZαA 分別用 EcoR I 和 Xba I 進(jìn)行雙酶切。酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后，使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段和線性化的載體。然后，在 T4 DNA 連接酶的作用下，將 Cryptonin 基因片段與線性化載體在 16℃下連接過夜，構(gòu)建重組表達(dá)載體 pPICZαA - Cryptonin。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌 DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，通過含有 Zeocin 的 LB 平板篩選陽性克隆。挑取陽性克隆進(jìn)行菌落 PCR 和測(cè)序驗(yàn)證，確保重組載體中 Cryptonin 基因序列的正確性。

畢赤酵母的轉(zhuǎn)化
將構(gòu)建好的重組表達(dá)載體 pPICZαA - Cryptonin 用 Sac I 線性化，然后通過電轉(zhuǎn)化的方法將線性化的重組載體導(dǎo)入畢赤酵母 GS115 感受態(tài)細(xì)胞中。電轉(zhuǎn)化參數(shù)經(jīng)過優(yōu)化，包括電壓、電容和電阻等，以提高轉(zhuǎn)化效率。轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞涂布在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上，在 30℃下培養(yǎng) 2 - 3 天，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子。

重組畢赤酵母的篩選與鑒定
對(duì)篩選出的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落 PCR 鑒定，使用載體上的通用引物和 Cryptonin 基因特異性引物，驗(yàn)證 Cryptonin 基因是否成功整合到畢赤酵母基因組中。同時(shí)，提取陽性轉(zhuǎn)化子的基因組 DNA，通過 Southern blotting 進(jìn)一步確認(rèn)基因整合情況，確定單拷貝和多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。

重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)
將篩選得到的陽性轉(zhuǎn)化子接種至含有一定濃度 Zeocin 的 BMGY 培養(yǎng)基中，在 30℃、250rpm 的條件下培養(yǎng)至 OD???約為 2 - 6。然后，離心收集細(xì)胞，用 BMMY 培養(yǎng)基重懸，并添加甲醇至終濃度為 0.5% - 1.0% 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)過程在 30℃下持續(xù)進(jìn)行，每隔 24 小時(shí)添加一次甲醇以維持誘導(dǎo)狀態(tài)。同時(shí)，設(shè)置不同的誘導(dǎo)時(shí)間（24、48、72、96 小時(shí)等）和甲醇濃度梯度（0.5%、0.75%、1.0%、1.25% 等），通過 SDS - PAGE 分析蛋白表達(dá)情況，優(yōu)化表達(dá)條件，以獲得最高的 Cryptonin 表達(dá)量。

表達(dá)產(chǎn)物的純化
誘導(dǎo)表達(dá)結(jié)束后，離心收集培養(yǎng)液，通過鎳瓊脂糖凝膠親和層析柱對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行初步純化。將培養(yǎng)液上樣至平衡好的親和層析柱，用含有低濃度咪唑（如 20 - 50mM）的緩沖液進(jìn)行洗滌，去除非特異性結(jié)合的蛋白，然后用含有高濃度咪唑（如 200 - 500mM）的緩沖液進(jìn)行洗脫，收集含有 Cryptonin 的洗脫峰。對(duì)初步純化的產(chǎn)物進(jìn)一步采用高效液相色譜（HPLC）進(jìn)行精細(xì)純化，選擇合適的色譜柱和流動(dòng)相條件，根據(jù)蛋白的保留時(shí)間收集目標(biāo)峰。

表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)譜分析：對(duì)純化后的蛋白樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI - TOF - MS）和電噴霧離子化質(zhì)譜（ESI - MS），測(cè)定蛋白的分子量，并與理論分子量進(jìn)行對(duì)比，確定表達(dá)產(chǎn)物是否為目標(biāo)蛋白 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列測(cè)定：采用 Edman 降解法測(cè)定純化后蛋白的 N - 末端氨基酸序列，與已知的 Cryptonin 氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)一步驗(yàn)證蛋白的正確性。

抗菌活性檢測(cè)：采用瓊脂擴(kuò)散法和液體稀釋法檢測(cè)純化后的 Cryptonin 對(duì)多種常見病原菌（如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、白色念珠菌等）的抗菌活性。在瓊脂擴(kuò)散法中，將病原菌均勻涂布在瓊脂平板上，在平板上打孔，加入不同濃度的 Cryptonin 溶液，培養(yǎng)后觀察抑菌圈大小。在液體稀釋法中，將 Cryptonin 溶液與病原菌菌液混合，在一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后，通過測(cè)定菌液的吸光度或平板計(jì)數(shù)法確定低抑菌濃度（MIC）和低殺菌濃度（MBC）。

三、結(jié)果

（一）Cryptonin 基因的克隆與重組表達(dá)載體的構(gòu)建

通過 RT - PCR 成功擴(kuò)增出 Cryptonin 基因片段，大小與預(yù)期相符。構(gòu)建的重組表達(dá)載體 pPICZαA - Cryptonin 經(jīng)菌落 PCR 和測(cè)序驗(yàn)證，表明 Cryptonin 基因已正確插入到載體中，且序列無突變。

（二）畢赤酵母的轉(zhuǎn)化與陽性轉(zhuǎn)化子的篩選

電轉(zhuǎn)化后，在含有 Zeocin 的 YPDS 平板上篩選出多個(gè)陽性轉(zhuǎn)化子。菌落 PCR 和 Southern blotting 結(jié)果顯示，部分轉(zhuǎn)化子中 Cryptonin 基因成功整合到畢赤酵母基因組中，其中包括單拷貝和多拷貝整合的轉(zhuǎn)化子。

（三）重組畢赤酵母的培養(yǎng)與誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化

通過優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間和甲醇濃度，SDS - PAGE 結(jié)果顯示，在誘導(dǎo) 72 小時(shí)、甲醇濃度為 1.0% 時(shí)，Cryptonin 的表達(dá)量最高。表達(dá)的蛋白在分子量大小上與理論值相符，主要以可溶形式存在于培養(yǎng)液中。

（四）表達(dá)產(chǎn)物的純化

經(jīng)過鎳瓊脂糖凝膠親和層析和 HPLC 純化后，獲得了純度較高的 Cryptonin 蛋白，SDS - PAGE 顯示單一清晰的條帶。

（五）表達(dá)產(chǎn)物的鑒定

質(zhì)譜分析：MALDI - TOF - MS 和 ESI - MS 結(jié)果表明，純化后的蛋白分子量與理論分子量基本一致，誤差在允許范圍內(nèi)，證實(shí)為 Cryptonin。

N - 末端氨基酸序列測(cè)定：Edman 降解法測(cè)得的 N - 末端氨基酸序列與已知的 Cryptonin 序列匹配，進(jìn)一步確認(rèn)了蛋白的身份。

抗菌活性檢測(cè)：瓊脂擴(kuò)散法和液體稀釋法結(jié)果顯示，表達(dá)的 Cryptonin 對(duì)測(cè)試的多種病原菌具有顯著的抗菌活性，其 MIC 和 MBC 值在一定范圍內(nèi)，表明具有良好的抗菌效果。

四、討論

（一）基因克隆與載體構(gòu)建的要點(diǎn)

在 Cryptonin 基因克隆過程中，引物設(shè)計(jì)至關(guān)重要，合適的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)選擇確保了基因與載體的正確連接。同時(shí)，PCR 反應(yīng)條件的優(yōu)化對(duì)于獲得高質(zhì)量、特異性的基因片段起到關(guān)鍵作用。在重組表達(dá)載體構(gòu)建時(shí)，連接反應(yīng)的條件如溫度和時(shí)間需要精確控制，以提高連接效率和減少載體自連。

（二）畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選的問題

電轉(zhuǎn)化過程中，參數(shù)的優(yōu)化對(duì)于提高轉(zhuǎn)化效率至關(guān)重要。不同的畢赤酵母菌株可能對(duì)電轉(zhuǎn)化參數(shù)有不同的要求，需要進(jìn)行摸索。在篩選陽性轉(zhuǎn)化子時(shí)，菌落 PCR 和 Southern blotting 兩種方法相結(jié)合能夠更準(zhǔn)確地確定基因整合情況，尤其是區(qū)分單拷貝和多拷貝整合，這對(duì)于后續(xù)表達(dá)量的調(diào)控有重要意義。

（三）表達(dá)條件優(yōu)化的意義

通過對(duì)誘導(dǎo)時(shí)間和甲醇濃度的優(yōu)化，能夠顯著提高 Cryptonin 的表達(dá)量。甲醇作為誘導(dǎo)劑，其濃度過高可能對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性，影響蛋白表達(dá)和細(xì)胞活性；濃度過低則無法有效誘導(dǎo)蛋白表達(dá)。合適的誘導(dǎo)時(shí)間也需要根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和蛋白表達(dá)動(dòng)態(tài)來確定，這需要大量的實(shí)驗(yàn)摸索。

（四）純化與鑒定方法的選擇

鎳瓊脂糖凝膠親和層析對(duì)于帶有組氨酸標(biāo)簽的重組蛋白具有較好的純化效果，但可能存在一些非特異性吸附，需要通過優(yōu)化洗滌和洗脫條件來提高純度。HPLC 作為一種高分辨率的純化方法，能夠進(jìn)一步去除雜質(zhì)，獲得高純度的蛋白。在鑒定方面，質(zhì)譜分析和 N - 末端氨基酸序列測(cè)定從不同角度對(duì)蛋白進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，而抗菌活性檢測(cè)則直接驗(yàn)證了表達(dá)產(chǎn)物的功能，為其應(yīng)用價(jià)值提供了依據(jù)。

五、結(jié)論

本研究成功實(shí)現(xiàn)了蟬抗菌肽 Cryptonin 在畢赤酵母中的高效表達(dá)，并通過多種方法對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行了準(zhǔn)確的純化和鑒定。表達(dá)的 Cryptonin 具有良好的抗菌活性，為其進(jìn)一步的大規(guī)模生產(chǎn)和在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用研究提供了重要的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和技術(shù)支持。未來可進(jìn)一步研究 Cryptonin 的作用機(jī)制，優(yōu)化表達(dá)體系以提高產(chǎn)量，并開展其在體內(nèi)的抗菌效果和安全性評(píng)估等相關(guān)研究。